J
Europe isches Patentamt
European Patent Office
Office europeen des brevets
0 Numero de publication: 0 244 326 B1
FASCICULE DE BREVET EUROPEEN
© Date de publication de fascicule du brevet: 1&0&93 @ Int. 01.^:601 N 33/48
@ Numero de d§pdt: 87401000.2
@ Date de depot: 30.04.87
0 Procede de detection et/ou d*indentification d'une substance biologlque dans un milieu liqulde a
i'aide de mesures 6lectriques, et disposittf destind d la mfse en oeuvre de ce procede.
®
Priority: 30.04.88 FR 8608315
@ TItuiaire: BIO MERIEUX Soci^tS anonyme dite:
Marcy t'Etolie
®
Date de publication de la demande:
F-692S0 Charbonnleres les Bains(FR)
04.11.87 Bulletin 87/45
@ Inventeur: Colin, Bruno
©
Mention de la delivrance du brevet:
22 rue de la Mairie
18.08.93 Bulletin 93/33
F-69660 Colionges au Mont d*Or(FR)
Inventeur: IMandrand, Bernard
0
Etats contractants design^s:
21 Petite Rue de la Doua
AT BE CH DE ES GB GR IT LI LU NL SE
F-69100 Villeurbanne(FR)
Inventeur: Marteiet, Claude
@
Documents citis:
18 Chemin des Combes Le Morateur 1
EP-A- 0 121 385
F-69370 St Didier au Mont d'Or(FR)
GB-A-2136130
Inventeur: Jaffrezic, Nicole
US-A- 4 490 216
10 Passage des Bruyeres
F-69130 Ecully(FR)
0 Mandataire: Nony, Michel et al
Cabinet NONY & CIE 29, rue Cambac6r6s
F-75008 Paris (FR)
CM
CO
CM
11 est rappele que: Dans un delai de neuf mois h compter de ia date de publication de la mention de la
^ delivrance du brevet europeen, toute perscnne peut faire opposition au brevet europeen delivre, aupres de
rOffice europeen des brevets. L'opposition doit etre formee par ecrit et motivee. Elle n'est reputee formee
UJ qu'apres paiement de la taxe d'opposition (art 99(1) Convention sur ie brevet europeen).
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13.10/3.6/3.3.1)
1
EP 0 244 326 B1
Description
La presents invention a pour objet un proc6cl6 de detection et/ou d'tdentification d'une substance
biologique dans un milieu liquide h i'aide de mesures ^lectriques, ainsi qu'un dispositif destine h la mise en
5 oeuvre de ce precede.
On sail que la detection de substances biologiques est te plus souvent effectuee h I'aide de r^actifs
dou^s d*affinit€ pour ces substances. En particulier. les m^thodes fonddes sur la reaction antig&ne-
anticorps sont bien connues. G^n^ralement ces m^thodes n^cessltent des temps d'incubation importants et
la revelation de la reaction est effectude h I'aide de marqueurs de coOt §lev6 et de manipulation delicate,
70 tels que des marqueurs radioactifs ou enzymatiques.
On a ^galement propose de ddtecter la reaction antlg^ne-anticorps en fixant les anticorps sur une
membrane et en utilisant les variations de difference de potentiel provoquies par ladite reaction k I'interface
membrane-solution pour faire varier le champ electrique transversal au voisinage d'un transistor a effet de
champ. II en resulte une variation de la r§sistivite entre drain et source du transistor que Ton peut mettre en
75 Evidence par une mesure potentiom^trique. Toutefois, de tels syst^mes se sont av^r^s non spdcifiques ;
voir par exemple J. JANATA et al., Annals New York Academy of Sciences, 286-292 (1984).
Le document GB-A- 2.136.130 decrit un dispositif en couche mince, comprenant des Electrodes
deposees sur un support isolant et recouvertes d'une couche de materiau dielectrique. Sur la surface libre
de la couche de dielectrique, et done parall&lement au champ eiectrlque, on depose un reactif capable de
20 reagir avec un partenaire chimique ou biologique eventuellement present dans un liquide 1 etudier. Pour la
mise en oeuvre, on depose une goutte du liquide etudie sur la couche de reactif et on note la variation de
capaclte du systeme d'eiectrodes. 11 s'agit done d*un systeme fonctionnant h sec, sans electrode au contact
du liquide. La modification de capacite est due h un effet lateral ou effet de bord, et la presence du
partenaire chimique ou biologique se traduit pas une augmentation de capacite.
25 Le brevet US 4.490.216 decrit un dispositif sensible aux modifications de polarite, comprenant un
support conducteur recouvert sur une face d'une couche isolante elle-meme surmontee d'une bicouche
llpidique. La couche llpidlque exteme est liee h un reactif tel qu'un anticorps. Pour rechercher si un liquide
contient un partenaire dudit reactif, on met en contact le dispositif avec le liquide, et on note la modification
eventuelle du potentiel entre le support conducteur et une electrode de reference.
30 On a maintenant decouvert qu'il est possible de detector une reaction d'affinite du type ligand-
substance biologique par un proc^de simple et sensible fonde sur des mesures d'impedance eiectrique du
circuit complexe forme par une solution contenant la substance biologique etudiee, une couche mince
isolante sur laquelle est fixee le ligand, et un support conducteur sur lequel est fixe risolant.
L'invention a done pour objet un precede de detection d'une substance biologique dans un milieu
35 liquide conducteur de reiectricite susceptible de la contenir, caracterise par le fait que Ton met en contact,
dans une cellule de mesure, ledit milieu liquide avec une plaque porte-reactif compdrtant un ligand
specifique fixe directement sur une face d'une couche mince en materiau isolant dont I'autre face est fixee
sur un support capable de conduire reiectricite, que I'on mesure les composantes 0 (capacite) et/ou R
(resistance) de i'impedance eiectrique du systeme milieu liquide/couche isolante/support pour une tension
40 donnee, et que Ton compare lesdites composantes a celles d'un systfeme de reference analogue au
precedent mais exempt de ligand specifique, une eventuelle diminution de la capacite ou une variation de
la resistance, par rapport au systeme de reference, signifiant la presence de ladite substance biologique
dans le milieu liquide etudie.
Generatement. il suffit de mesurer la capacite eiectrique du systeme mais dans certains cas la mesure
45 de resistance est plus sensible.
Le procede de invention s'applique k toute substance biologique capable d'etre reconnue par un
ligand doue d'affinite pour ladite substance.
Parmi les couples ligand-substance biologique, on citera par exemple les couples anticorps-antigene,
haptene-anticorps, ADNc-ADN, ADNc-ARN, poly dT-ARNn^ eucaryote, enzyme-substrat, enzyme-inhibiteur
50 d'enzyme, lectine-glycoconjugue, marqueur de cellules (ou^de microorganismes)-cellules (ou microorgani-
sme), HcG-recepteur tissulaire, et Ts-TBQ (thyroxin binding globulin) et, d'une fagon generale, les couples
recepteur biologique-Iigand correspondant (ou agoniste ou antagoniste). Selon les cas. Tun ou Tautre
element du couple pourra etre fixe sur la couche isolante.
Le ligand peut egalement etre un marqueur de cellules ou de microorganismes, par exemple un
55 marqueur du typage ceilulaire, la substance biologique etant alors constituee par les cellules ou microorga-
nismes que Ton souhaite identifier ou dont on recherche !e type.
Dans la suite de la description, on fera souvent reference, par commodite, au systeme antigene-
anticorps. Cette simplification est purement conventionnelle et ne doit bien entendu pas etre consideree
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com me limitative.
La capacity ou la resistance mesuree sera fonction de I'epaisseur (fixe) de la couche dMsolant et de
r^paisseur et de la density (variable) de la couche de ligand et de substance biologique fix6s.
La sensibility du syst6me est bien entendu fonction des dimensions relatives de la couche isolante
5 (epaisseur) et de la substance biologique etudi^e. II est clair en outre que !e ligand fixe sur la couche
isolante doit avoir les dimensions les plus faibles possible.
Au contraire, les substances destinees h §tre fixees sur le systeme isolantmgand doivent avoir les
dimensions les plus grandes possible, et on peut dans certains cas augmenter la sensibility de la detection
h I'aide de divers artifices bas^s sur ce principe. Par exemple, lorsque la substance biologique ^tudi^e
10 comporte plusieur sites d'affinit§, on peut ajouter au liquide etudie, apr^s mise en contact dudit liquide avec
la plaque porte-r^actif. un second ligand qui viendra se fixer h son tour sur les sites d*affinlt§ encore llbres
de ladite substance biologique. si elle est presente. en augmentant ainsi I'epaisseur des couches d^pos^es'
sur risolant. Le second ligand peut etre identique ou non au ligand fixe sur Tisolant.
On peut encore augmenter la sensibility en fixant le second ligand sur une macromoiycule telle qu'une
75 protyine ou sur de petltes particules Individuelles capables de se maintenir en suspension dans le milieu
liquide. Ces particules sont par exemple des particules solides (latex, polystyrene, et...) ou des microglobu-
les tels que des liposomes.
Le liquide conducteur peut etre toute solution tampon compatible avec le systeme biologique utilise. Ce
milieu liquide peut avoir une conductivity ^quivalente h celle d'une solution aqueuse de chlorure de sodium
20 ayant une concentration pouvant aller de 0,01 5M h 3M. Le pH du milieu liquide peut etre compris entre 2 et
11. Les Interactions non sp6cifiques par ^change d'ions ou par interactions hydrophobes peuvent etre
combattues par des tampons de force ionique appropriee contenant eventuellement des detergents utilises
classiquement a cet effet.
Pour mesurer les composantes R et C du systeme obtenu on met en contact une electrode
25 inattaquable avec le liquide etudie et Ton ^tablit une tension alternative entre ladite electrode et ledit
support conducteur. On determine lai capacity et/ou la resistance du systeme k une tension donnee selon
les mythodes connues. On compare ensuite avec la grandeur correspondante mesuree avec le systeme de
ryference.
On applique en outre une tension de polarisation, de Tordre de quelques volts au maximum, au support
30 conducteur de la plaque porte-ryactif. par rapport a une yiectrode de refyrence, par exemple une yiectrode
au calomel. On fait gynyralement verier la tension de polarisation (positive ou negative) et on dytermine
ainsi facilement la tension de polarisation qui permet d'observer les variations optimales des composantes
R ou C.
Oyneralement, les tension optimales de polarisation, pour la dytermination de la composante C, varient
35 de 1 .5 ^ 5 volt, le plus souvent de 3 a 5 volts. On observe toujours une diminution de la capacity.
Pour la determination de la composante R, les tensions de polarisation optimales sont voisines de la
tension nulle, gynyralement entre - 1 volt et + 1 volt. Les variations de la ryslstance dependent du systeme
reactif-antigene utilise. Avec certains systfemes, on observe une augmentation de la ryslstance, et une
diminution avec d*autres syst§mes.
40 La mesure peut etre ryalisee. pour la detection des proteines, par fixation directe sur I'anticorps
specifique lui-m§me fixe sur la phase solide, avec ou sans amplification. On peut avantageusement utiliser
des fragments Fab h la place des anticorps entiers, les fragments Fab ytant prepares par exemple selon
une methode analogue h celle decrite par E, Ishikawa, J. Immunoassays, 4, 209 (1983).
Pour mesurer une concentration de petite molecule (haptene) la methode par competition peut etre
46 preferable, en particulier en fixant Thaptene sur la phase sotide par Tintermedlaire d'un agent chimique de
couplage et en mesurant la fixation de Tanticorps specifique, d'autant plus importante que I'echantillon est
plus pauvre en molecule k doser.
La methode Inverse avec un anticorps fixe et un haptfene lie k une molecule ou une particule de grosse
taille peut egalement etre utillsee.
50 Pour la recherche ou le typage cellulaire, la nr>ethodologie presentee est particulierement attractive du
fait de la taille importante des cellules qui, en se fixant, vont entraTner une chute tres forte de la capacite
mesuree.
Les domaines d'application recouvrent done notamment Tensemble des determinations immunologi-
ques sur cellules, proteines ou haptenes. La surface active est recuperable pour une nouvelle mesure apres
55 lavage avec un agent dissociant du complexe forme, par exemple par lavage actde puis equilibrage.
Le systeme se prete blen a des determinations multiples sur un seul echantillon, que ce soit en
recherche d'anticorps, d'antigene ou d'haptene ou en typage cellulaire. Toutes ces determinations peuvent
etre effectuees simultanement en quelques minutes avec une surface portent autant de plaquettes greftees
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que de determinations souhait^es, une ou plusleurs plaquettes t^moins fixant le niveau du bruit de fond.
Le dispositif peut etre plan ou cylindrique avec un volume d'^chantillon ^ventuellement tr§s limits.
Un example d'un tel dispositif peut §tre fournl par un syst§me de recherche des microorganismes
pathogfenes dont la presence est 6ventuellement attendue sur un ^chantillon resultant d'un pr6l6vement de
5 selles ou d'un dcouvillonnage.
Le syst§me de mesure capacitif est par ailleurs utilisable h temperature tr^s ^levee, ce qui permet
d'optlmiser la temperature reactionnelte.
Un exemple tr§s important d'application est constltu^ par I'hybridation de sondes nucieiques. Du fait de
la taille des ADN et ARN, plus eiev^e que celle des prot^ines correspondantes, une chute capacitive
70 importante sera mesurde aprfes une hybridation entre un oligonucleotide fixe sur une plaquette de silice et
Tacide nucieique portant la sequence compiementalre.
L'ensemble du systeme de mesure resistant h des temperatures eievees voisines de 95 • C, la totalite
du processus de recherche des sequences nucleiques specifiques pourra etre realisee dans la meme cuve.
Le chauffage est effectue d'abord pour deshybrider ; ensuite la reaction specifique peut etre suivie par
75 abaissement regulier de la temperature.
Apres eievation de la temperature de la cuve» au-dessus de la temperature critique d'hybridatlon, et
lavage a force lonique faible, la cuve est utilisable h nouveau pour une determination nouvelle.
Comme dans le cas des systdmes jmmunologiques, le signal obtenu peut etre amplifie par une
deuxieme sonde nucieique utilisee dans la phase liquide, seule ou liee h une macromoiecute ou une
20 particule de taille Importante.
Le procede de invention permet d'effectuer non seulement des determinations qualitatives, mais aussi
des determinations quantitatives. Pour cela. it suffit d'etalonner la cuve de mesure, munie de plaques porte-
reactif normalisees, avec des quantites connues croissantes de la substance biologique que Ton veut
detecter ou identifier.
25 L'invention a egalement pour objet une plaque porte-reactif destinee a la mise en oeuvre du precede
decrit ci-dessus.
Cette plaque porte-reactif est caracterlsee par le fait qu'elle comporte un support en matenau capable
de conduire reiectricite, recouvert sur une de ses faces par une couche mince isolante sur laquelle est fixe
directement un ligand pour une substance biologique.
30 Dans des modes de realisation particuliers, la plaque porte-reactif peut encore presenter les caracteris-
tiques suivantes :
- le materiau capable de conduire reiectriclte est un metal et la couche isolante est une couche
d'oxyde de ce metal ; le metal est par exemple I'aluminium, le tantale, etc...
- ou bien le support est constitue par un materiau semi-conducteur et II comporte, sur la face opposee
35 h ta face recouverte de la couche isolante, une couche metallique destinee h assurer un contact
ohmique ; le semi-conducteur est par exemple le slllcium et la couche Isolante est une couche de
silice ; (Si02) ou de nitrure de silicium (SisN*).
- le support a generalement une forme plane ; il peut aussi avoir par exemple une forme tubulaire ou
une forme de coupe hemispherique ;
40 - le ligand est fixe sur la couche isolante par adsorption, ou bien il est greffe sur la couche isolante par
covalence.
Pour preparer une plaque pprte-reactif on peut par exemple Toxyder superficiellement en atmosphere
d*oxygene h temperature convenabte. L'epaisseur de la couche d'oxyde isolante peut etre facilement
regiee, par exemple en falsant varier le temps de reaction pour une temperature reactionnelle donnee.
'^s De preference on utilise des plaques dont la couche isolante a une epatsseur inferieure a 0,1 um.
Le ligand peut etre fixe par adsorption sur la couche isolante ; on connatt par exemple les proprietes
adsorbantes de Talumine ou de la silice qui sont largement utilisees en chromatographie.
On peut egalement greffer le ligand par covalence en utilisant un reactif de couplage bifonctionnel
capable de reagir a la fois avec la couche isolante et avec le ligand. L'utilisation de tels reactifs est bieri
50 connue.
Par exemple, dans le cas de la silice, on peut greffer par covalence les molecules aminees, y compris
les proteines h Taide d'un derive de silane de formute :
(Alk 0)3 Si - X - R
55
dans laquelle
- Alk represente un alkyle inferieur,
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- X represent© un bras hydrocarbone tel qu'un alkylene inf^rieur
et
■ R est un groupement reactif tel qu'un groupement NH2.
Ce compost r^agit avec la sllice pour donner une siiice substitute, par exempte du type :
5
0 Alk
I
Siiice -0-Sl-X-R
On peut alors facilement fixer une molecule aminee, sur la siiice ainsi modifiee, a faide d*un reactif
bifonctionnel qui ttablit des liaisons h la fois avec le groupement reactif R et avec les groupement NH2 du
75 llgand. Par exemple lorsque R reprtsente NH2. on peut utiliser un dialdthyde. Le groupement carbonyle
reagit avec le groupement NH2 pour former une imine qui peut etre reduite, si desir4. en groupement amini
correspondant, par exemple h Taide d'un borohydrure.
Une telle methode de greffage sur la siiice est dtcrite notamment par P.J. ROBINSON et coll.,
Biochimtca et Biophysica Acta 242, 659-661 (1971).
20 D'autres methodes de greffage sur siiice qui peuvent etre utilis^e sont celles d^crites notamment par
M.K. WEIBEL et coll., Biotechnology and Bioenglneering. V0I.XVII, 85-98 (1975) ; Y. HAMAGUCHI et coll.,
Eur. J. Biochem. 71, 459-467 (1976) ; H.H. WEETALL et coll., Biotechnology and Bioengineering, Vol. XVIII,
105-118 (1976) ; et H.D. CRONE et coll., Journal of Chromatography. 129. 91-96 (1j976).
L'invention concerne egalement une cuve de mesure destinSe a mettre en oeuvre le precede defini cl-
25 dessus. Cette cuve de mesure est principalement caract^ris^e par le fait qu'elle comprend une enceinte
comportant un espace interne pour I'tchantillon liquide, un receptacle pour une plaque porte-r^actif
amovible, permettant de mettre en communication la face interne, portant la couche isolante munle du
ligand, de ladite plaque, avec Tint^rieur de Tenceinte, et tventuellement un second receptacle pour une
plaque de reference sans ligand specifique. des moyens pour assurer retanch§ite entre I'enceinte et
30 lesdites plaques, une Electrode susceptible d'§tre en contact avec ledit echantlllon liqulde, et des moyens
pour assurer des contacts tlectriques exttrieurs pour rtlectrode et pour la face exteme des plaques.
LMnvention va maintenant etre decrite plus en detail en falsant reference aux desslns annexes dans
iesquels :
- la figure 1 est un schema fonctionnel d'un systfeme de mesure permettant la mise en oeuvre du
35 precede de invention et
- les figures 2 et 3 representent des vues schtmatlques en coupe de modes de realisation particuliers
de la cuve de mesure ;
- la figure 4 represente la variation de capacity en fonctlon du temps dans les conditions tndiquees h
I'exemple 3 ;
40 - et la figure 5 repr6sente les variations de capacity observees, en fonction de la concentration en
proteine, avec deux plaques porte-reactif prtpartes de fagon identique (voir exemple 3).
Le dispositif complet comprend une cuve de mesure 1, un module d'aljmentation en tension 2
(potentiostat) reglable command^ par un calculateur 3. La plaque porte-reactif 4 servant d*electrode de
travail est par exemple une plaquette de silicium. Sur la face superieure de cette plaquette (figure 1), le trait
45 epaissi 4a represente la couche de siiice sur laquelle ont ete greffes par exemple. des anticorps.
L*echantillon liquide 5 present dans la cuve de mesure est en contact avec cette couche de siiice munie du
ligand. Le contact ohmique de la face interieure de la plaquette 4 est realise par une couche d'or non
representee, obtenue par evaporation sous vide.
Une electrode 6 (electrode au calomel par exemple) qui sort d'electrode de reference, est reliee au
50 potentiostat 2, assurant son asservissement et done une polarisation bien definie de la plaquette de silicium
par rapport a Techantillon liquide. Un tel systeme est necessaire dans le cas d'une plaquette en semi-
conducteur afin d'imposer a celui-ci une une tension de polarisation suffisante. superieure au travail de
sortie, permettant de rendre ce materiau conducteur.
Le potentiostat 2 est Egalement reli§ h une contre-eiectrode en platine 7 et permet d'appliquer h cet
55 electrode une tension alternative dont la frequence peut varier par exemple depuis 1 kHz Jusqu'li 1
megaherz. Le potentiostat est alimente par le generateur 2A. L'analyse du signal fait intervenir un modele
mathematique de circuit RC. On peut done effectuer a la fois une mesure de la resistance et une mesure
de capacite pour la m§me tension appliquee. L'analyse du signal retour par le module de mesure du
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courant 8 permet de connaltre les composantes R et C de l'imp§dance du systems qui sont transmrses au
calculateur 3. les r^sultats sont transcrits par rimprimante 9.
La tension alternative appliquie (qui se superpose h la tension de polarisation 4ventuellenrient apptiqu^e
k la plaque porte-rdactif) peut avoir une amplitude allant de 1 millivolt k quelques volts. Cette tension doit
5 §tre compatible avec la stability du milieu llquide et des substances blologlques presentes.
La cuve de mesure de la figure 2 est constitute par exemple d'un bloc isolant en polycarbonate dont la
partle infSrieure 10 comporte deux logements respectlvement pour la plaque porte-rtactif 11 et la plaque de
r€Mrence 12. Les disposltifs de fixation des plaques 11 et 12 n*ont pas 6X6 reprtsentis. La partie
suptrieure 13 peut etre thermostatee.
70 Entre les parties inferieure et suptrieure est mtnag§ un espace creux 14 pour r§chantil!on llquide, avec
un orifice d'entrte 15 et un orifice de sortie 16. Dans I'espace interne creux 14 est dispos^e une Electrode
en platine 17. La face suptrieure de la plaquette 11 » destinie k etre en contact avec Techantlllon llquide^
etudier, est constitute par une couche mince de sillce sur laquelle est greffe le ligand sptcifique et !a face
superieure de la plaque de reference 12 est constitute par une couche mince de silice sans ligand
75 sptciftque. De prtftrence, la plaque de rtftrence porte une couche monomoltculaire de m§me nature (par
exemple une immunogiobuline non sptciflque) que le ligand de la plaquette 11. Par comparaison des
composantes R et C obtenues avec les plaquettes 1 1 et 1 2, ce disposltif permet d'effectuer une mesure
differentielle et d'ellminer ainsi les effets d'une eventuelle adsorption non specifique..
Le dispositif de la figure 3 reprtsente schtmatiquement, en agrandissement, une cellule de mesure
20 miniaturiste.
Dans ce dispositif, la plaque porte-reactif 18 avec la couche isolante 18a munle de rtactif (ligand
specifique) et la plaque de reftrence munie de la couche de sillce 19a, tventuellement revetue d*une
molecule non specifique de meme nature que le ligand sptcifique, sont disposees en regard Tune de Tautre
; elles sont stpartes par un espace etroit 20, dans lequel une fraction 24 de la goutte d'echantillon llquide
25 25 deposee sur le fond de la cuve 26 peut s'Instrer et etre retenue par capillarite. Blen entendu, les
dimensions relatives de I'espace 20 ont ttt agrandies pour la clarte du dessln. A I'extremltt Inftrieure, la
base de la goutte llquide est en contact avec une tiectrode en platine reprtsentte par un trait tpaissi 21.
La face exteme des plaques 18 et 19 est dans ce cas revitue d'un vemis isolant 22, 23. On peut ainsi faire
des mesures sur des echantillons de quelques microlltres.
30
EXEMPLE 1 : Obtention d*une plaque porte-rtactif
On utilise des plaquettes de sllicium doptes de type p ayant 6cm de diamfetre et 0,2 mm d'tpaisseur,
commerclalistes par la societt CSEM (Neufchatel, Suisse).
35 Par oxydation en atmosphere d'oxygehe a 1200*0 pendant 24heures d*une des faces de la plaquette,
on obtient une couche de silice ayant une tpaisseur de 700 Angstroms.
L'autre face est rendue conductrlce par metallisation par evaporation d'or sous vide.
Apres hydratation de la couche de silice pendant 48heures en atmosphere de vapeur d'eau k 100*0,
on immerge les plaquettes dans une solution de 3-aminopropyltritthoxysilane k 2% dans I'acttone peridant
. 40 24heures ^ 45 • 0.
On lave les plaquettes a I'acttone et on seche.
On immerge ensuite les plaquettes dans une solution de glutaraldehyde k 1% dans I'eau distlllte
pendant 1 heure k22'C, puis on les lave avec un tampon phosphate 0,25M de pH 7.5.
On laisse incuber dans une solution d'immunoglobulines (2mg/ml) prtalabtement dialyste contre du
45 tampon phosphate a 0,25M.
Apres incubation pendant 12heures a 4*0, on lave les plaquettes avec un tampon PBS-Tween 20
pendant 1/2 heure a 37'C. Le Tween 20 est une marque commerciale pour un detergent non ionique.
Les plaquettes sont conservees dans une solution de tampon PBS-Tween 20.
On a grefft sur les plaquettes, selon cette methode, soit des immunoglobulines polyclonals ou
50 monoclonales anti-alphafoetoprottine, soit des immunoglobulines polyclonales anti-lgE.
EXEMPLE 2 : Essai avec Talphafoetoprottine
On utilise un dispositif analogue k celul de la figure 1.
55 La frequence du signal est de lOkMz avec une amplitude de 5 mV.
Le llquide etudie consiste en des solutions tampon contenant des concentrations crbissantes d'antigene
(alphafoetoproteine).
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Avec des plaquettes de silicium simplement recouvertes de silrce, mais non greffees. les tampons
saHns de type PBS ou glycine, avec ou sans incubation avec des proteines animates, ne donnent pas de
variations significatlves de la capacity du systeme quelle que soit la concentration en antigfene dans le
milieu de mesure et dMncubation.
Par contre, avec une plaquette sur laquelle a ete greffee rantlcorps anti-alphaproteine comme decrit h
rexemple 1, on observe une diminution de la capacity. Pour une tension de polarisation du silicium de
I'ordre de + 1.5 Volt par rapport h r§lectrode au calomel on a mesur6 les capacit^s suivantes :
- plaquette de reference : C = 5,71. IC^F
- plaquette porte r^actif avec anticorps greffis : C = 4,40.1 0'^F.
Un essai avec un tampon ne contenant pas d'antig^ne a donn^ la valeur suivante : C = 4,40.1 0'^F.
Avec un tampon contenant lOng/ml d'antigfene, on a trouv§ C = 4,35.10-8F.
Avec un tampon contenant 300ng/ml d'antiglne, on a trouv6 C = 4^7.1 O^^p
EXEMPLE 3 : Essals de reproduction avec I'alphafoetoprot^ine.
On utilise un dispositif analogue a celui de la figure 1.
La plaquette porte un anticorps anti-alphafoetoproteine couple par covalence. Concentration de Tantige-
ne : 400ng/ml.
Les conditions de travail sont les m§mes que pour Texemple 2.
Les i^sultats obtenus en fonction du temps (fig.5) montrent que la fixation Ag/Ac (polyclonal) s'effectue
selon une courbe cinetique du premier ordre AC = f (t) lineaire pour des temps courts, ce qui permet des
mesures quantitatlves!
Les memes mesures peuvent etre effectuees successivement, apr^s lavage acide, sur la mime
plaquette activee.
Par ailleurs, deux plaquettes preparees de fagon identique donnent des resultats reproductibles (fig.6)
en fonction de la concentration de protelne (mesures effectuees apres 15 minutes d'incubation).
Dans ce dernier cas, i*anticorps etart un anticorps monoclonal.
EXEMPLE 4 : Essai avec I'lgE humaine
On opere de fapon analogue h celle decrite a I'exemple 2.
L'antigene est ici I'lgE humaine testee h. diverses concentrations (0 ; 0.2 ; 2 ; 20 ; 200ng/ml).
On utilise des plaquettes sur lesquelles on a greffe des anticorps de ch§vre anti-lgE humaines. On a
obtenu les resultats suivants :
- tampon sans antigfene : C = 6,04.10"^ F.
- tampon contenant 200ng/ml :
C = 5,88.1 O^'^F (apr§s 5 minutes d'incubation)
C = 5,90.1 0-8 F (aprfes 30 minutes d'incubation).
Apres lavage de la plaquette dans un tampon glycine h pH acide pour d^crocher les anticorps anti-lgE,
on retrouve pratiquement la capacity observee au depart avec le melange tampon : C = 6.05.1 0~^F.
Apr§s une nouvelle incubation de la plaquette ainsi reg§ner6e avec Tantigene, on retrouve le signal
caract^rlstique des s6rums positifs en antlgfene.
Sur une plaquette sur laquelle a 6\6 greffee une proteine non specifique (I'albumine humaine), on
n'observe pas de variations significatives du signal apres incubation avec des tampons contenant jusqu'a
200ng/ml d'antigenes (anticorps anti-lgE). Les courbes C = f (V) sont pratiquement superpos^es (V etant la
tension de polarisation de la plaquette, par rapport a relectrode au calomel).
Le signal specifique est amplifre par I'ajout posterieur d'anticorps anti-lgE dans la phase liquide.
L*augmentation d'epaisseur de la couche depos4e qui en resulte se traduit par une diminution plus
importante de la capacite.
On a en effet observe en effet les valours suivantes :
- tampon seul : C = 6,97.10"^ F
- tampon a 200ng/ml d'antigene : C = 6,88.1 0'^F
- tampon h 200ng/ml d'antigene avec ajout posterieur d'anticorps anti-lgE : C = 6,74.1 0'^F.
La tension 6e polarisation du silicium 6tait de + 3 Volt par rapport h relectrode au calomel,
Le systeme d'amplification par I'anticorps ajout^ en milieu liquide peut etre utilise pour de faibles
concenti-ations d'antigenes (2ng/ml) avec un effet mesurable comme le montre le Tableau 1 .
EP 0 244 326 B1
TABLEAU 1
Concentration en antigene
Variation specifique de
Variation non specifique
(IgE) en ng/ml
capacite(anti-lgE) X 10^^ Farad
(albumlne)x 10^^ Farad
0
0
0
2
88
20
200
125
47
La sensibility obtenue sans compensation de la fixation non specifique est done de I'ordre de 2ng. Avec
une mesure differentielle entre une surface portant une proteine non specifique telle que de Talbumine et
une surface portant un anticorps specifique, on peut atteindre une sensibilite tres superieure et detecter des
concentrations inferieures a 1 ng/ml.
Les r^sultats precedents ont ^t^ acquis pour un temps d'incubation et de mesure (5 a 30 minutes) tres
court par rapport aux autres methodes de sensibilite comparable. Le signal optimal est generalement
obtenu au bout de 5 minutes d'incubation. Bien entendu. la Vitesse de reaction est augmentee avec des
anticorps greffes hautement specifiques.
20
25
30
EXEMPLE 5 : Essai de mesure de capacite et de resistance.
On opere de fagon analogue k celle d^crite k Texemple 4 (antigene : IgE humaine).
Les tampons utilises sont des tampons PBS contenant 0,05% de Tween 20.
Les mesures de capacite ont ^te effectuees pour une tension de polarisation de la plaque, par rapport k
I'electrode au calomel, de + 4 Volt.
Les mesures de resistance ont eX6 effectuee pour une tension de polarisation de la plaque, par rapport
h ('electrode au calomel, de + 0,2 Volt.
La frequence du signal alternatif superpose est de 10 kHz,, avec une amplitude de 5mV.
Les resultats sont resumes dans le Tableau 2 ci-apres,
TABLEAU 2
plaquette greff4e
concentration en IgE
C{nF)
Co-C
R (Ohm)
Ro-R
Anti-lgE
0 ng
Co = 72,45
Ro = 24,60
1 ng
71,57
0,88
21.60
3.00
100 ng
71.20
1,25
20.27
4,33
Albumlne (reference)
0 ng
Co = 70,33
Ro = 16.04
1 ng
70,13
0,20
15.92
+ 0.12
100 ng
69.86
0.47
16.13
-0,09
35
40
45
Revendlcatlons
50
55
1. Procede de detection d'une substance biologique dans un milieu liquide conducteur de I'electricite
susceptible de la contenir, caracterise par le fait que Ton met en contact, dans une cellule de mesure.
ledit milieu liquide (5. 14. 24) avec une plaque porte-reactif (4. 11. 16) comportant un ligand specifique
de la substance h detecter fixe directement sur une face d'une couche mince en materiau isolant (4a.
11a. 18a) dont I'autre face est fixee sur un support capable de conduire I'electricite, que Ton mesure
les composantes C et/ou R de {'impedance eiectrique du syst&me milieu liquide/couche
isolante/support pour une tension donnee. et que Ton compare lesdites composantes k celles d'un
systeme de reference (12,19) analogue au precedent mais exempt de ligand specifique, une eventuelle
diminution de la capacite ou une variation de la resistance, par rapport au systeme de reference,
signifiant la presence de ladite substance biologique dans le milieu liquide etudie.
8
EP 0 244 326 B1
2. Precede salon la revendication 1 , caract6ris§ par le fait que le couple Irgand-substance biologique est
choisi parmi les couples antlcorps-antig^ne. haptene-anticorps, ADNc-ADN, ADNc-ARN, poly dT-ARNm
eucaryote, enzyme-substrat. enzyme-inhibiteur d'enzyme, lectine-glycoconjugu^.marqueur de cellules
(ou de microorgantsmes)-cei!uIes (ou microorganismes), HcG-recepteur tissulaire et Ta -TBG, et tout
5 couple du type recepteur biologique-{llgand correspondant ou agoniste ou antagoniste).
a Proced6 selon Tune quelconque des revendications pr^cederrtes. caract€ris§ par le fait que, pour
augmenter la sensibility de la detection dans le cas ou ladlte substance biologique comporte plusieurs
sites d*affinit6, apres avoir nr^is en contact ie liquide 6tudi6 avec la plaque porte-reactif, on ajoute audit
10 liquide un second ligand, et que Ton effectue ensuite la mesure de la capacity et/ou de la resistance du
syst&me obtenu.
4. Proc§d6 selon la revendication 3, caractdris6 par le fait que ledit second ligand est fix6 sur une
macromolScule telle qu'une proteins ou sur de petites partlcules individuelles capables de se maintenir
75 en suspension dans ledit nrtitieu liquide.
5. Procede selon Tune quelconque des revendications precedentes, caracteris6 par le fait que ledit ligand
est greffd sur la couche isolante par covalence.
20 6. Proc^dd selon Tune quelconque des revendications pr^cedentes. caractdris^ par le fait que, pour
mesurer les composantes de rinap§dance ^lectrlque, on met une Electrode inattaquable (7. 17, 21) en
contact avec ledit liquide, on §tablit une tension alternative entre ladite Electrode et ledit support
conducteur et on determine les composantes R et/ou C selon les m^thodes usuelles, pour une tension
donnee.
25
7. Plaque porte-r^actif destin^e h la mise en oeuvre du proc6d§ tel que d^fini dans Tune quelconque des
revendications precedentes, caract^risee par le fait qu'elle comporte un support (4, 11, 12, 18, 19) en
mat^riau capable de conduire relectricit^ recouvert sur une de ses faces par une coucfie mince
isolante (4a, 18a) sur laquelle est fix^ directement un ligand pour une substance biologique.
30
a Plaque porte-rdactif selon la revendication 7, caracteris^e par le fait que ledit support est en mdtal et •
que ladite couche isolante est une couche d'oxyde de ce metal.
9. Plaque porte r^actif selon la revendication 8, caract^ris^e par le fait que ledit mitaJ est Taluminlum ou
35 le tantale.
10. Plaque porte-riactif selon la revendication 7, caracteris§e par le fait que ledit support est constitu§ par
un materiau semi-conducteur et qu*l! comporte, sur la face oppos^e h la face recouverte de materiau
isolant, une couche m^tallique destin^e h assurer un contact ohmique.
40
11. Plaque porte-r^actif selon la revendication 10, caract^ris^e par le fait que ledit semi-conducteur est le
siliclum et que la couche isolante est une couche de silice ou de nitrure de siliclum.
12. Plaque porte-reactif selon i'une quelconque des revendications 7 a 11, caract6rls6e par le fait que ledit
45 ligand est fixe sur la couche isolante par adsorption.
13. Plaque porte-reactif selon Tune quelconque des revendications 7 2i 11, caract^ris^e par le fait que ledit
ligand est greffe sur la couche isolante par covalence.
50 14. Cuye de mesure destinie h mettre en oeuvre le proced^ de Tune quelconque des revendications 1 S 6,
comprenanl une enceinte comportant un espace interne (14, 20) pour Pechantillon liquide, un recepta-
cle pour une plaque porte-reactif amovible (4, 11, 18), permettant de mettre en communication la face
interne, portent la couche isolante munie du ligand. de ladite plaque, avec Tinterieur de I'enceinte, et
eventuellement un second receptacle pour une plaque de reference sans ligarKt specifique. des
65 moyens pour assurer Tetancheite entre I'enceinte et lesdites plaques, une electrode susceptible d'etre
en contact avec ledit echantillon liquide, et des moyens pour assurer des contacts electriques
ext^rieurs pour T^lectrode et pour la face externe des plaques, caracterisee par le fait qu'elle comprend
une plaque porte-reactif selon Tune quelconque des revendications 7^13.
9
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Claims
1. Method for detecting a biological substance in an electrically conducting liquid medium capable of
containing it, characterised In that the sard liquid medium (5, 14, 24) is brought into contact, in a
5 measuring cell, with a reagent-carrier plate (4, 11, 18) containing a specific ligand for the substance to
be detected bound directly to one face of a thin layer of insulating material (4a, 11a, 18a), the other
face of which is hound to a support capable of conducting electricity; in that the C and/or R
components of the electrical impedance of the liquid medium/insulating layer/support system are
measured for a given voltage; and in that the said components are compared with those of a reference
10 system (12, 19) similar to the above but devoid of specific ligand, a possible decrease in the
capacitance or a change in the resistance, relative to the reference system, denoting the presence of
the said biological substance in the liquid medium in question.
2. Method according to Claim 1. characterised in that the biological substance-ligand system Is chosen
75 from antibody-antigen, hapten-antlbody, cDNA-DNA, cDNA-RNA. poly(dT)-eukaryotic mRNA. enzyme-
substrate, enzyme-enzyme inhibitor, lectin-glycoconjugate, cell marker (or microorganism marker)-cells
(or microorganisms), HcG-tissue receptor and T3-TBG systems, and any system of the biological
receptor-(agonist or antagonist or corresponding ligand) type.
20 3. Method according to either of the preceding claims, characterised in that, to increase the sensitivity of
the detection in cases where the said biological substance contains several affinity sites, after the liquid
in question has been brought into contact with the reagent-carrier piate, a second ligand is added to the
said liquid, and in that the measurement of the capacitance and/or the resistance of the system
obtained Is then performed.
25
4. Method according to Claim 3, characterised in that the said second ligand is bound to a macromolecule
such as a protein or to individual small particles capable of being maintained in suspension in the said
liquid medium.
30 5, Method according to any one of the preceding claims, characterised in that the said ligand is grafted
covalently onto the Insulating layer.
6. Method according to any one of the preceding claims, characterised in that, to measure the compo-
nents of the electrical impudence, an electrode incapable of being attacked (7, 17, 21) is brought into
35 contact with the said liquid, an a.c. voltage Is established between the said electrode and the said
conducting support and the R and/or C components are determined according to the usual methods,
for a given voltage:
7. Reagent-carrier plate designed for carrying out the method as defined In any one of the preceding
40 claims, characterised in that it contains a support (4, 11, 12, 18, 19) made of a material capable of
conducting electricity, covered on one of its faces with a thin insulating layer (4a, 18a) to which a ligand
for a biological substance is bound directly.
8. Reagent-carrier plate according to Claim 7. characterised In that the said support is made of metal and
45 that the said insulating layer is a layer of oxide of this metal.
9. Reagent-carrier plate according to Claim 8, characterised in that the said metal is aluminium or
tantalum.
50 10. Reagent-carrier plate according to Claim 7, characterised in that the said support consists of a
semiconducting material and that it contains, on the face opposite the face covered with insulating
material, a metallic layer designed to provide for ohmic contact.
11. Regent-canrier plate according to Claim 10, characterised in that the said semiconductor is silicon and
55 that the insulating layer Is a layer of silica or of silicon nitride.
12. Reagent-carrier plate according to any one of Claims 7 to 11, characterised in that the said ligand is
bound to the insulating layer by adsorption.
10
EP 0 244 326 B1
13. Reagent-carrier plate according to any one of Claims 7 to 1 1 , cliaracterised in that the said ligand is
grafted covatently onto the insulating layer.
14. Measuring call designed for carrying out the method of any one of Claims 1 to 6, comprising an
5 enclosure containing an internal apace (14. 20) for the liquid sample, a receptacle for a removable
reagent-carrier plate (4, 11, 18), enabling the inner face, bearing the insulating layer equipped with the
ligand. of the said plate to be brought into communication with the inside of the enclosure, and
optionally a second receptacle for a referance plate without a specific ligand, means for providing for
sealing between the enclosure and the said plates, an electrode capable of being in contact with the
10 said liquid sample, and means far providing for external electrical contacts for the electrode and for the
outer face of the plates, characterised In that it comprises a reagent-carrier plate according to any one
of Claims 7 to 13.
Patentanspriiche
IS
1. Verfahren zum AufspOren einer biologischen Substanz in einem flOssigen Milieu, das in der Lage 1st,
einen elektrischen Leiter zu enthalten. gekerinzeichnet durch die Tatsache, dass man das flussige
Milieu (5, 14, 24) innerhalb einer MeBzelle mit einer ein reagierendes Mittel tragenden Platte (4, 11, 18)
In Kontakt bringt. welche eInen spezifischen Liganden der aufzuspOrenden Substanz trSgt, der direkt
20 auf einer Oberflache eines sehr kleinen Bettes aus einem isolierenden Material (4a, 11a, 18a),befestigt
ist, wahrend die andere Flache auf einem Trager befestigt ist, der in der Lage ist, den elektrischen
Strom zu leiten, 'daB man die GrdBen C und/oder R der elektrischen Impedanz des Systems aus
flUssigem Milieu/isolierendem Bett / trSger fur eine geigebene Spannung miBt und daB man die
genannten GroBen mit denjenigen eines Referenzsystems (12, 19) vergleicht, das dem vorgenannten
25. System analog ist mit der Ausnahme des spezifischen Liganden, wobei eine eventuelle Verminderung
der Kapazitat oder eine Abweichung des Widerstandes hinslchtlich des Referenzsystems gemessen
wird, welche die Gegenwart der biologischen Substanz im untersuchten f lOsslgen Milieu anzeigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass das Paar aus Ligand und
30 biologischer Substanz ausgewahlt Ist aus den Paarungen AntikSrper-Antlgen, Hapten-Antikorper, ADNc-
ADN, ADNc-ARN, Poly-dT-ARN^ Eucaryot, Enzym-Substrat. Enzyminhibitor, Lectin-GIycoconjugiertes
Substrat, Zellmarkierer (oder von Mikroorganismen) - Zellen (oder Mikroorganismen) HcG - Gewebere-
zeptor und T3-TBG sowie jede weitere Paarung vom Typ biologischer Rezeptor - (entprechender
Ugand oder Agonist oder Antagonist).
35
3. Verfahren nach den vorhergehenden Anspruche gekennzeichnet durch die Tatsache, dass man zur
Erhohung der Empfindlichkeit der Aufspurung in dem Fall, dass die biologische Substanz mehrere
AffinitStsstellen besitzt, nachdem man die Untersuchungsflussigkelt nriit der das Reaktlonsmittel tragen-
de Platte in Kontakt gebracht hat. zu der Flussigkelt einen zwelten Liganden zusetzt und dass man
40 erneut das Messen von KapazitSt und/oder Widerstand des erhaltenen Systems durchfQhrt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch die Tatsache. dass der zweite Ligand auf einem
Makromolekul fixiert ist, wie ein Protein oder auf kleine einzelne Partikel, die in der Lage sind, In
Suspension in dem flussigen Milieu gehaiten zu werden.
45
5. Verfahren nach den vorhergehenden Anspruchen. gekennzeichnet durch die Tatsache, daB der
Ligand auf das isolierende Bett durch kovalente Bindungen aufgepfropft ist.
6. Verfahren nach den vorhergehenden Anspruchen, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass man
50 zum Messen der GroBen der elektrischen Impedanz eine nicht angreifbare Elektrode, (7. 17, 21) In
Kontakt mit der genannten Flussigkeit bringt, dass man eine alternative Spannung zwischen dieser
Elektrode und dem leitfahigen Trager einrichtet und dass man die GroBen R und/oder C mit den
ubiichen Methoden fur eine gegebene Spannung bestimmt.
65 7. Platte als Trager fur ein Reaktlonsmittel zur Verwendung in dem Verfahren, wie es in den vorstehenden
Anspruchen definiert ist, gekennzeichnet durch die Tatsache. dass sie aus einem Trager (4, 11. 12,
18, 19) aus einem Material besteht. das in der Lage ist, die Elektrizitat zu leiten, wobei eine der
Flachen mit einem sehr kleinen Isolierbett (4a, 18a) bedeckt ist. auf welchem unmittelbar ein Ugand fur
11
EP 0 244 326 B1
eine biologische Substanz fixiert ist.
a Platte als Trager fOr ein Reaktionsmittel nach Anspaich 7, gekennzelchnet durch die Tatsache, dass
dieser TrSiger ein Metall ist und dass das Isolierbett ein Bett aus einem Oxyd dieses Metalles ist.
9. Platte als Trager fUr ein Reaktionsmittel nach Anspruch 8, gekennzelchnet durch die Tatsache» dass
das Metall Aluminium oder Tantal ist.
10. Platte als TrSger fUr ein Reaktionsmittel nach Anspruch 7, gekennzelchnet durch die Tatsache, dass
dieser Trager aus einem halbleitenden Material besteht und dass es auf der Flache, die der mit dem
isolierenden Material bedeckten FIMche gegenOber liegt, mit einem Metallbett beschichtet ist, das einen
Ohm'schen Kontakt sicherstellt.
11. Platte als Trager fUr ein Reaktionsmittel nach Anspruch 10, gekennzelchnet durch die Tatsache, dass
der Halbleiter aus Silicium ist und dass das Isolierbett ein Bett aus KieselsSure und Siliclumnitrid ist.
12. Platte als Trager fOr ein Reaktionsmittel nach einem der AnsprUche 7 bis 11, gekennzelchnet durch
^ die Tatsache, dass der Ligand auf dem Isolierbett durch Adsorption fixiert ist.
13. Platte als Trager fUr ein Reaktionsmittel nach einem der AnsprOche 7 bis 11, gekennzelchnet durch
die Tatsache, dass der Ligand auf das Isolierbett durch kovalente Bindungen aufgepfroptt ist.
14. MeBkQvette, bestimmt fUr das Messen nach dem Verfahren der AnsprUche 1 bis 6. die eInen
umftossenen Raum darstellt mit einem Innenraum (14, 20) zur Aufnahme der Flussigkeit, einem
Behalter fur eine Platte, die ein Reaktionsmittel trSgt und auswechselbar ist (4, 11, 18), die es gestattet,
eine Messung in Verbindung mit der InnenflSche durchzufuhren, welche ein Isolierbett trSgt, auf
weichem ein Ligand auf der Platte befestlgtlst, mit einem Innenraum des umschlossenen Raums und
wobei gegebenenfalls ein zweiter AufnahmebehSlter fur eine Referenzplatte ohne spezifischen Ligan-
den vorgesehen ist, und daS Mitte! vorgesehen sind, urn die Dichtigkeit zwischen dem umschlossenen
Raum und den Platten sicherzustellen, und eine Elektrode vorgesehen ist, mit deren Hilfe der Kontakt
mit der flOssigen Probe hergestellt werden kann und Mittel vorgesehen sind, um die elektrischen
Kontakte nach auBen zwischen Elektrode und AuBenflache der Platten sicherzustellen. dadurch
gekennzelchnet, dafi sie eine Platte als Trager fur ein Reaktionsmittel nach einem der AnsprUche 7
bis 13 enthalt.
12
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13
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V£RS
ME5URE
VERS^
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14 - ■
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^ MESURE
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EP 0 244 326 B1
Method for detecting and/or identifying a biological substance in a liquidmedium with the... Page 1 of 3
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Goto: Derwent
S Emai
S Title:
Derwent Title:
T Country:
Kind:
EP0244326B1: Method for detecting and/or identifying a biological s
in a liquidmedium with the aid of electrical measurements, and apps
carryingout this method[ German][French1
Detecting biological cpd. having specific binding affinity - by incubation
with specific reactant immobilised on insulating layer, then measuring
resistance or conductance roenwent Recordi
EP European Patent Office (EPO)
B1 Patent « (See also: EP0244326A2 . EP0244326A3 . EPQ244326TD )
1^ Inventor:
^Assignee:
^Published / Filed:
* Application
Number:
IPC Code:
t Priority Number:
-Abstract:
Attorney, Agent
or Firm:
i INPADOC
Legal Status:
Colin, Bruno;
Mandrand, Bernard;
Marteiet, Claude;
Jaffrezic, Nicole;
BIO MERIEUX Society anonyme dite:
News. Profiles. Stocks and More about this company
1993-08-18/1987-04-30
EP1987000401000
G01N 33/48:
1986-04-30 FR1986000006315
[From equivalent EP0244326A2 ] The method is for the detection
of a biological substance in an electrically conducting liquid medium
capable of containing it. In a measurement ceil (1), the said liquid
medium (5) is put into contact with a reagent-carrying plate (4)
incorporating a specific ligand fixed directly onto one face of a thin
layer of dielectric material (4a) whose other face is fixed onto an
electrically conducting support. The C and/or R components of the
electric impedance of the system consisting of the liquid medium,
the insulating layer and the support is measured for a given voltage.
The said components are compared with those of a reference
system similar to the above system but without the specific ligand.
Any reduction in the capacitance or variation in the resistance in
comparison with those of the reference system indicates the
presence of the said biological substance in the liquid medium
concerned. The invention also includes the measurement cell for
carrying out the method.
Nony, Michel et al ;
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7/19/2004
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